16/04/2023
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TIỂU CẦU TRỞ KHÁNG NHỮNG LƯU Ý
1. Phương pháp đo tiểu cầu trở kháng
Đây là phương pháp được sử dụng bởi hầu hết các máy phân tích tại nhiều phòng xét nghiệm. Nó hoạt động rất tốt khi không yếu tố gây nhiễu nào. Với phương pháp đo trở kháng, các tế bào lần lượt đi qua khe đếm. Có các điện cực ở mỗi bên và dòng điện trực tiếp đi qua các điện cực này. Các tế bào đi qua tạo ra sự thay đổi điện trở dòng điện trực tiếp và do đó tín hiệu điện tử tương xứng với thể tích của nó. Do đó, các tế bào được xác định dựa trên kích thước của chúng và được biểu diễn trong một đường cong phân bố, gọi là ‘Histogram” (Hình 1), số lượng được xác định bởi tổng các xung trong một phân bố kích thước nhất định.
Trong điều kiện sinh lý, các tế bào hồng cầu (RBC) và tiểu cầu khác nhau rõ ràng về kích thước tế bào của chúng và có thể được phân biệt dễ dàng bằng phương pháp trở kháng. Do đó các thiết bị có thể phân biệt một cách đáng tin cậy, các quần thể sẽ được tách biệt tối ưu với nhau. Phân tách rõ hai quần thể: tiểu cầu (kích thước sinh lý 8 - 12 fL và đo trong khoảng 2 - 30 fL) và hồng cầu (kích thước sinh lý 80 - 100 fL và đo trong khoảng 25 - 250 fL). Trong điều kiện bệnh lý, khi tiểu cầu lớn hơn 30 fL (ví dụ: tiểu cầu khổng lồ) hoặc khi các tế bào hồng cầu nhỏ hơn 25 fL (ví dụ như tế bào mảnh, hồng cầu nhỏ) thì không thể phân tách rõ ràng. Trrường hợp như vậy, máy phân tích huyết học thường đưa ra một cảnh báo tương ứng và phải thực hiện kiểm tra tính hợp lý của mẫu bằng một phương pháp khác.
2. Các yếu tố gây nhiễu khi đo tiểu cầu bằng pp trở kháng
Các yếu tố gây nhiễu có thể dẫn đến kết quả tiểu cầu thấp hoặc cao giả tạo. Các thành phần sau đây có thể gây ra nhiễu khi đo trở kháng được sử dụng:
2.1. Tiểu cầu khổng lồ (Giant platelets)
Tiểu cầu rất lớn - lớn hơn kích thước trung bình hồng cầu - được gọi là tiểu cầu khổng lồ (ví dụ như trong Hình 2). Chúng có thể được tìm thấy trong các bệnh bẩm sinh, như hội chứng Bernard-Soulier và các bệnh về tủy xương như MDS (Myelodysplastic syndromes), AML (Acute Myeloid Leukemia) và tăng tiểu cầu nguyên phát.
Do kích thước của chúng tương tự như kích thước của các tế bào hồng cầu, tiểu cầu khổng lồ có thể vượt quá giá trị ngưỡng kích thước tiểu cầu bình thường. Điều này giải thích tại sao yếu tố nhiễu có thể phát sinh với phương pháp đo trở kháng, chỉ phân biệt các hạt theo kích thước của tế bào. Tuy nhiên, máy sẽ được đưa ra dưới dạng cảnh báo. Các tiểu cầu lớn bị tính nhầm là RBC và nếu cảnh báo bị bỏ qua có thể dẫn đến số lượng tiểu cầu giảm giả tạo. Để xác định số lượng tiểu cầu chính xác, phải được đánh giá lại bằng một phương pháp thay thế.
2.2 Tiểu cầu kết cụm hay ngưng kết tiểu cầu (Platelet aggregation and platelet agglutination)
Số lượng tiểu cầu thấp giả tạo thường là do sự hiện diện của các cụm tiểu cầu (Platelet clumps), hiếm gặp hơn, do sự hình thành vệ tinh (Platelet satellitism) trong mẫu máu. Chúng ta có thể phân biệt giữa kết tập tiểu cầu và ngưng kết. Sự kết tập tiểu cầu là sự kết cụm của các tiểu cầu trong máu. Đó là một phần của chuỗi các sự kiện dẫn đến sự hình thành của một cục huyết khối (cục máu đông), và nó không thể đảo ngược. Hiện tượng này chủ yếu xảy ra do kích hoạt tiểu cầu sau khi lấy máu tĩnh mạch bị lỗi.
Mặt khác, sự ngưng kết tiểu cầu (Hình 3) là một quá trình có thể đảo ngược, thường gây ra bởi sự hiện diện của kháng thể trong máu. Một ví dụ là kháng thể lạnh, trong đó protein gắn vào tiểu cầu ở nhiệt độ dưới 34°C dẫn đến giảm tiểu cầu giả tạo. Đây là hiện tượng được quan sát ngoài cơ thể, điều này không xuất hiện ở nhiệt độ sinh lý (37°C). Các nguyên nhân khác có thể dẫn đến giảm tiểu cầu giả tạo là sự không tương thích với các chất chống đông máu EDTA hoặc, hiếm hơn với heparin hoặc citrate. Tiểu cầu phát triển vệ tinh là cũng là một hiện tượng phụ thuộc vào kháng thể, EDTA. Tất cả những hiện tượng này là xảy ra trên kỹ thuật in vitro và không xảy ra trong trong cơ thể. Hiện tượng trên hiếm gặp với tỉ lệ khoảng 0,07 – 0,2% trong quần thể và 0,1 – 2% với nhóm người bệnh nhập viện (2) và do chủ đề này rộng và có nhiều vấn đề phải bàn nên sẽ được thảo luận trong một bài khác (cập nhật sớm).
Trong nhiều trường hợp, hệ thống máy xét nghiệm huyết học đưa ra một cảnh báo tương ứng và đường cong phân phối bất thường. Nhưng cần phải xem xét rằng cụm tiểu cầu có thể không được hệ thống hút vào do sự phân bố không đồng nhất trong mẫu, và nó vẫn có thể còn trong ống máu. Trong trường hợp đó, các cụm không thể được phát hiện và kết quả là số lượng tiểu cầu thấp giả tạo. Nói chung, giá trị tiểu cầu được xác định là không hợp lý mặc dù đã kiểm tra thêm trên lam máu và nên được đánh giá trong mẫu máu lấy lại.
2.3 Mảnh vỡ tế bào (Fragmentocytes)
Giá trị tiểu cầu tăng giả tạo có thể được gây ra bởi các mảnh hồng cầu (Hình 4). Nhiều mảnh nhỏ hơn 25 fL và do đó giảm xuống dưới giá trị phân biệt trên của tiểu cầu. Ngay cả với các giá trị phân biệt khác nhau, không phải lúc nào cũng có thể tách các tế bào hồng cầu rất nhỏ hoặc các mảnh tế bào với tiểu cầu. Trong những trường hợp này, số lượng tiểu cầu chính xác có thể được xác định bằng cách sử dụng thuốc nhuộm gắn RNA (Phương pháp PLT-F) hoặc dấu ấn miễn dịch, hoặc thậm chí bằng cách đếm buồn đếm (thủ công). Hiện tượng trên cũng có thể xảy ra nếu có các mảnh tế bào bạch cầu. Các hạt như vậy có thể được tính là tiểu cầu khi sử dụng phương pháp trở kháng.
2.4 Hồng cầu nhỏ (Microcytic RBC)
Hồng cầu phân loại là nhỏ bất thường bởi thể tích trung bình đo được và có thể gây nhiễu đến kết quả số lượng tiểu cầu (1). Có nhiều nguyên nhân gây ra hồng cầu nhỏ: Bệnh tan máu bẩm sinh hoặc bệnh lý hemoglobin, thiếu máu thiếu sắt. RBC nhỏ thường được tính là tiểu cầu bằng phương pháp trở kháng của máy phân tích huyết học, vì kích thước của chúng tương tự như của tiểu cầu dẫn đến kết quả tiểu cầu tăng cao giả tạo (thường là tăng rất cao).
2.5 Vi khuẩn
Các hạt rất nhỏ, như các mảnh WBC hoặc không phải các hạt tế bào của người giống như vi khuẩn, cũng có thể được đếm thành tiểu cầu. Tuy nhiên, vì kích thước hạt thường ít hơn hơn 2 fL, hệ thống tạo ra một cảnh báo và yêu cầu xem lại giá trị nền và cần giải quyết vấn đề nếu cảnh báo được lặp lại. Một vài ví dụ về biểu đồ tiểu cầu bị ảnh hưởng bởi các yếu tố gây nhiễu có thể nhìn thấy trong biểu đồ (Hình 5 và 6.).
3. Các phương pháp thay thế
3.1 Sử dụng buồng đếm (thủ công)
Vì nhiều lý do: Tốn thời gian, kết quả không chính xác mà ngày nay xét nghiệm đếm tiểu cầu bằng phương pháp thủ công. Đặc biệt phương pháp thủ công đối với các mẫu máu số lượng tiểu cầu thấp là rất không chính xác.
3.2 Ước tính số lượng thiểu cầu theo phương pháp Fonio
Phương pháp này khá hữu ích để xác định nhanh, kiểm tra độ chính xác của số lượng tiểu cầu (tự động) nhất định. Nó được thực hiện qua kính hiển vi trên lam máu bình thường ở độ phóng đại 1.000 lần (mắt 10, thị kính 100). Ở đó, số lượng tiểu cầu trong một vi trường được đếm và sau đó được sử dụng để ước tính tổng số tiểu cầu: 1 tiểu cầu trên mỗi trường vi mô tương đương với số lượng tiểu cầu là 20.000/µL máu. Rõ ràng, các giá trị được ước tính theo phương pháp này luôn chỉ mang tính xấp xỉ và không thể chính xác nhưng khá hữu ích trong những trường hợp đặc biệt.
3.3 Sử dụng phương pháp ghi dấu Fluorescence (chế độ RET- máy của Sysmex)
Đây là phương pháp nhanh chóng và chi phí vừa phải cho việc xác định số lượng tiểu cầu trong máu thông qua gắn huỳnh quang của RNA tiểu cầu. Việc gắn huỳnh quang axit nucleic này cho phép hệ thống xác định giá trị tiểu cầu chính xác dựa trên tín hiệu huỳnh quang và thể tích tế bào. Nó cũng sẽ phân loại đúng các tiểu cầu khổng lồ (cùng thể tích với các tế bào hồng cầu, nhưng khác nhau về hàm lượng RNA) và các tế bào mảnh (không có RNA) (Hình 7) (3,4) .
3.4 Sử dụng phương pháp miễn dịch ghi dấu CD61/CD41
Đây là phương pháp đáng tin cậy và được sử dụng để tham chiếu cho việc xác định chính xác tiểu cầu, tuy nhiên chi phí đắt và rất khó có thể triển khai tại các phòng xét nghiệm (4).
3.5 Phương pháp đo quang (hệ thống máy của hãng Abbott và Siemens)
Tiểu cầu trước tiên được xử lý cầu hóa đẳng thể tích (isovolumetrically sphered) bằng SDS và cố định bằng Glutaraldehyde nhằm loại trừ sai sót có thể có do những tư thế khác nhau của tiểu cầu khi đi ngang điểm đo. Sau khi xử lý, tiểu cầu (và cả hồng cầu) được đổi thành một hình cầu có cùng thể tích như ban đầu, nhưng có thể đo trong mọi tư thế mà vẫn phản ảnh đúng thể tích hồng cầu (red cell volume). Khi đi ngang điểm đo (flowcell), sử dụng nguồn sáng là laser diod 670nm, và phân tích tán xạ (scattered light tiểu cầu được khảo sát 2 chiều ở ngưỡng thấp, phân tích góc hẹp (2-3 độ) phản ảnh kích thước tiểu cầu (volume), còn phân tích góc rộng (5-15 độ) phản ảnh mật độ tế bào (Cell density). Tín hiệu thu được trên mỗi góc là một cặp dữ liệu liên quan đến mỗi tiểu cầu đi ngang qua điểm đo (nguyên tắc khảo sát từng tế bào – cell-by-cell) và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie như khảo sát hồng cầu (Hình 8).
Điểm đặc biệt là phương pháp này không loại trừ các tiểu cầu to (large platelets), nhưng để phân tích và đếm số lượng tiểu cầu to sẽ có nguy cơ nhầm lẫn với các thành phần khác như: mảnh hồng cầu, bóng ma hồng cầu… ; cũng như kích thước của tiểu cầu to thường chồng lẫn với hồng cầu, đặc biệt là hồng cầu nhỏ. Do đó cần thêm yếu tố mật độ tế bào (Cell density), và tiêu chí để phân biệt tiểu cầu thực sự so với các thành phần khác được căn cứ theo bảng mô tả (Hình 9).
Do đó, kết quả báo cáo số lượng tiểu cầu sẽ được tính chung với số tiểu cầu to đếm được, nhưng đã loại trừ các thành phần không phải là tiểu cầu. Ngoài ra khi số lượng tiểu cầu to vượt quá một giới hạn nhất định, sẽ có lưu ý hình thái Large Platelets hay Platelet Clump tương ứng. Ngoài ra còn có có cảnh báo hình thái tương ứng khác (RBC Fragments, RBC Ghosts).
4. Kết luận
Đếm tiểu cầu bằng trở kháng là phương pháp phổ biến với chi phí hợp lý với các phòng xét nghiệm, tuy nhiên cần kiểm soát và phát hiện các yếu tố có thể gây nhiễu để đưa ra kết quả chính xác nhất. Có nhiều phương pháp thay thế (tóm lược trong hình 10) trong trường hợp phát hiện các yếu tố gây nhiễu, tùy vào điều kiện của phòng xét nghiệm có thể lựa chọn để phương pháp thích hợp.
Msc. Chinh Nguyen (Biên dịch và tổng hợp)
Nguồn:
Tài liệu tham khảo
Mach-Pascual S et al. (1996): ‘Investigation of microcytosis: A comprehensive approach’. Eur. J. Haematol. 57(1) : 54 – 61.
Baccini V, Geneviève F, Jacqmin H, et al. Platelet Counting: Ugly Traps and Good Advice. Proposals from the French-Speaking Cellular Hematology Group (GFHC). J Clin Med. 2020;9(3):808. Published 2020 Mar 16. doi:10.3390/jcm9030808
Schoorl M. et al. (2013): New Fluorescent Method (PLT-F) on Sysmex XN2000 Hematology Analyzer Achieved Higher Accuracy in Low Platelet Counting. Am J Clin Pathol. 140 : 495 – 490.
Tailor H et al. (2014): Evaluating platelet counting on a new automated analyser. Hospital Health Care Europe (HHE). 2 : 181 – 184.
Park SH et al. (2014): The Sysmex XN-2000 Hematology Autoanalyzer Provides a Highly Accurate Platelet Count than the Former Sysmex XE-2100 System Based on Comparison with the CD41/CD61 Immunoplatelet Reference Method of Flow Cytometry. Ann Lab Med. 34(6) : 471 – 474.
https://fr.scribd.com/.../Sysmex-SEED-Platelet-detection...
